雙靶點(diǎn)CRISPR載體構(gòu)建 (哺乳動(dòng)物細(xì)胞)

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1. CRISPR/Cas9核酸酶切靶序列原理圖

2 相關(guān)載體圖譜

2.1 中間載體 ，sgRNA載體（預(yù)設(shè)有BbsI酶切位點(diǎn)）

中間載體

2.2 CRISPR/Cas9骨架載體，表達(dá)CAS9，同時(shí)有完整的sgRNA表達(dá)框

含有CAS9的骨架載體

（骨架載體可以換成PX459、PX461，PX462、lenticrispr V2、lentiguide-puro或者其他同種gRNA scaffold的質(zhì)粒）

3. 基因組靶位點(diǎn)選擇和雙鏈接頭設(shè)計(jì)

3.1 靶位點(diǎn)選擇

根據(jù)目的基因的物種在sgRNA設(shè)計(jì)網(wǎng)站上是設(shè)計(jì)靶點(diǎn)序列，根據(jù)需要選擇特異性好的兩個(gè)sgRNA靶點(diǎn)序列。

注（20nt靶點(diǎn)中F和R是為了標(biāo)記序列方向的堿基，F--R為正向，R--F為反向互補(bǔ);N和M都代表任意堿基，本文N20代表sgRNA1，M20代表sgRNA2）

對(duì)一個(gè)目的基因設(shè)計(jì)2個(gè)靶點(diǎn)。建議在ORF 5’區(qū)和功能結(jié)構(gòu)域各設(shè)計(jì)1個(gè)靶點(diǎn)，使之任何1個(gè)靶點(diǎn)的突變都可以產(chǎn)生功能缺失，或2個(gè)靶點(diǎn)之間的序列被敲除。

3.2引物設(shè)計(jì)

PCR產(chǎn)物核心公共序列

gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttgttttCTAGCAAAATAGGCTGTCCCCGCGGGGCATGACTATCGTCgagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccG

PCR擴(kuò)增后的序列

GaagacaccaccG-FNNNNNNNNNNNNNNNNNNR-gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttgttttCTAGCAAAATAGGCTGTCCCCGCGGGGCATGACTATCGTCgagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccG-FMMMMMMMMMMMMMMMMMMR-gtttaggtcttc

引物共用序列

F: GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAA

R: CGGTGTTTCGTCCTTTCCAC

設(shè)計(jì)完成的序列

sgRNA1-F(PX458):

5-gaagacaccaccGFNNNNNNNNNNNNNNNNNNRGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3

sgRNA2-R:

5- gaagacctaaacRMMMMMMMMMMMMMMMMMMFCGGTGTTTCGTCCTTTCCAC -3

注1：這一對(duì)引物是以PX458/PX459為骨架載體，選擇BbsI酶切位點(diǎn)（lentiguide和lenticrispr v2建議設(shè)計(jì)為BsmBI），同時(shí)正向引物需要加長(zhǎng);

注2：這種方法設(shè)計(jì)引物比較長(zhǎng)，引物合成和后續(xù)PCR會(huì)有困難，也可以每條sgRNA設(shè)計(jì)兩個(gè)短的引物進(jìn)行巢式PCR。

3.3 PCR擴(kuò)增序列

根據(jù)設(shè)計(jì)的兩個(gè)靶點(diǎn)的引物，擴(kuò)增插入序列

以pCMV-sgRNA-hU6-Twinstrep為模板擴(kuò)增得到如下目的序列

4 中間gRNA表達(dá)盒與表達(dá)CAS9骨架載體的連接

本載體系統(tǒng)可采用2種策略進(jìn)行Cas9載體和多個(gè)gRNA表達(dá)盒片段的一次連接組裝： 

策略I：用Golden Gate cloning (ligation)方法 (Engler et al., 2008; 2009)；

策略II：是傳統(tǒng)的酶切回收保存，酶切后的載體可以多次使用，片段單獨(dú)酶切回收的方法。注：策略II載體單獨(dú)回收保存，設(shè)計(jì)中間gRNA表達(dá)盒擴(kuò)增引物時(shí)，可以自由選擇實(shí)驗(yàn)室比較適宜的IIS限制性內(nèi)切酶，不一定需要和載體同樣的酶。

5 測(cè)序檢測(cè)

構(gòu)建成功之后的雙sgRNA表達(dá)框如下

兩個(gè)表達(dá)框中間設(shè)計(jì)有測(cè)序引物RVP3可以測(cè)序sgRNA2表達(dá)框，測(cè)序引物RVP4可以測(cè)序sgRNA1表達(dá)框。因兩個(gè)表達(dá)框序列相識(shí)度比較高、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，可能會(huì)導(dǎo)致測(cè)序結(jié)果不好。如果骨架載體常用建議在骨架載體上重新選擇引物測(cè)序，選距離兩側(cè)大于200bp遠(yuǎn)的位置設(shè)計(jì)測(cè)序引物。

附件

中間載體pCMV-sgRNA-hU6-Twinstrep介紹

1，pCMV-sgRNA-hU6-Twinstrep中插入的sgRNA表達(dá)框不是正常的結(jié)構(gòu)，而是倒置的結(jié)構(gòu)，不能單獨(dú)使用，需要配合原有的sgRNA表達(dá)框（插入hU6- -gRNA scaffold之間）使用，才能形成（hU6- gRNA scaffold-hU6- gRNA scaffold）雙表達(dá)框結(jié)構(gòu)。

插入序列結(jié)構(gòu) BbsI-gRNA scaffold-測(cè)序引物-hU6啟動(dòng)子-BbsI

紅色G是根據(jù)addgene部分構(gòu)建好的質(zhì)粒經(jīng)驗(yàn)，在sgRNA的20個(gè)堿基之前，建議保留sgRNA插入紅色G和gRNA scaffold之間。

插入序列中引入引物RVP3和RVP4作為測(cè)序引物，是熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒的常用引物，為防止和Cas9骨架質(zhì)粒引物重復(fù)導(dǎo)致無法測(cè)序。為了壓縮質(zhì)粒大小（省錢），兩個(gè)表達(dá)框之間沒有插入太多堿基，盡管插入兩個(gè)比較常用引物序列，結(jié)構(gòu)復(fù)雜也有可能導(dǎo)致測(cè)序套峰或者中斷的可能。如果測(cè)序不好建議在骨架質(zhì)粒上設(shè)計(jì)引物測(cè)序

載體中sgRNA表達(dá)框兩側(cè)都加了BbsI酶切位點(diǎn)，在以pX458/pX459等酶切位點(diǎn)為BbsI為酶切位點(diǎn)的Cas9骨架載體時(shí)候，引物可以相對(duì)小一些。

5-gaagacaccaccGFNNNNNNNNNNNNNNNNNNRGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3

2，為了不浪費(fèi)的原則，我們構(gòu)建載體的時(shí)候?qū)⑦@個(gè)sgRNA-U6的表達(dá)框插入到一個(gè)哺乳動(dòng)物過表達(dá)載體中，切掉sgRNA-U6表達(dá)框就是一個(gè)完整的帶有Twin-Strep-tag (Schmidt et al., 2013)的超小過表達(dá)空載體。sgRNA表達(dá)框兩側(cè)設(shè)計(jì)有兩個(gè)XhoI酶切位點(diǎn)，用XhoI酶切之后回收自連即可。

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